我们研发人员知道，校准品的稀释是量值传递的核心环节，直接影响检测结果的准确性和可靠性，逐级稀释（多次稀释）与一次性稀释（一步稀释）是两种常用方法，但关于两者不确定度的争议长期存在。今天就结合实验数据、不确定度理论和行业实践，系统分析两种方法的差异及适用场景。

01 稀释方法的技术原理与不确定度来源

逐级稀释是将高浓度校准品分多步稀释至目标浓度，如1000 ppm → 100 ppm → 10 ppm。

不确定度来源：每步稀释均引入体积测量误差，移液器/容量瓶允差；步骤增多导致随机误差累积如温度波动、操作重复性；基质效应逐级放大，如稀释液成分差异影响蛋白稳定性。

而一次性稀释是直接从高浓度校准品一步稀释至目标浓度，如1000 ppm → 1 ppm。

不确定度来源：单次大倍数稀释需高精度量具，如大容量移液枪或天平；稀释液与校准品基质兼容性要求高，否则易导致非线性偏差；对初始浓度准确性依赖性强，若原始标准品误差大，结果偏差显著。

02 不确定度的核心差异：理论与数据对比

通过实际计算可量化两种方法的不确定度差异，以配制1 mg/L标准溶液为例：

逐级稀释：1 ml原液（1000 ppm）→ 定容至100 ml（10 ppm）→ 取10 ml定容至100 ml（1 ppm）。相对不确定度为0.00711 mg/L，主要来自3次体积测量误差累积。

一次性稀释：1 ml原液（1000 ppm）直接定容至1000 ml（1 ppm）。相对不确定度为0.00707 mg/L，主要依赖1 ml移液管和1 L容量瓶的允差。

在理想条件下，使用A级量具，两者不确定度差异极小约0.6%，但逐级稀释因步骤多，操作失误风险更高。

03 影响不确定度的关键因素

量具精度是决定性因素，若使用低精度工具，如微量移液枪，一次性稀释的不确定度显著上升。例如，10 μl移液枪的允差（±1%）远高于1 ml移液管（±0.01 ml）。建议大家大倍数稀释优先选用大容量A级玻璃量具，避免使用100 μl以下微量枪。

基质效应与稳定性，校准品常为人源基质如血清，多次稀释可能改变基质成分，导致抗原构象变化或聚集。如β-肌动蛋白在>5次稀释后回收率下降12%。建议大家蛋白类校准品推荐一次性稀释；无机离子（如Na⁺）可耐受多次稀释。

环境与操作控制，温度波动对体积测量的影响在逐级稀释中被放大。实验显示，4°C储存校准品若未平衡至室温即稀释，体积误差可达0.5%。

04 IVD实践建议

根据应用场景选择最优方案，优先一次性稀释的情况：目标浓度≤1 μg/L，如肿瘤标志物检测；校准品含不稳定成分如酶、抗体；具备高精度自动稀释设；

选择逐级稀释的情况：稀释倍数>1000倍，且无大容量量具；需避免基质突变，如脂质校准品分步调整溶剂浓度。

通用优化策略：溯源控制，全程使用有证标准物质，赋值过程记录不确定度传递链；技术升级，采用数字PCR（dPCR）等绝对定量技术，规避稀释需求，如直接输出拷贝数/μL；质量控制，每批稀释后验证回收率要求95–105%。

在规范操作下，两种稀释方式的不确定度无本质差异，但逐级稀释更易受人为因素干扰。但通过自动化设备与溯源体系的完善，稀释过程的不确定度将逐步逼近理论最小值。

因此，IVD从业者应摒弃简单化的“步数少等于误差小”观念，正确的策略是：根据目标稀释倍数，科学选择最合适的稀释策略，并始终优先使用高精度量具，配合严格规范的操作和优化的稀释液，才能最大程度地控制稀释过程引入的不确定度，确保IVD校准品量值的准确可靠，最终保障临床检测结果的质量。